Quanto à técnica de Western Blot, analise as afirmativas a seguir. I. Na análise de proteínas por eletroforese em condições desnaturantes, os polipeptídios ligam-se ao reagente SDS (dodecil sulfato de sódio) e tornam-se carregados negativamente. II. Na transferência de polipeptídios do gel de poliacrilamida para membranas de nitrocelulose é importante que a membrana esteja próxima ao eletrodo negativo, uma vez que a transferência se dá do polo positivo para o negativo. III. O substrato cromógeno NBT/BCIP é um dos mais utilizados para revelar os anticorpos conjugados à peroxidase. Está correto o que se afirma em
- A)I, somente.
A alternativa reúne apenas a assertiva I. Ela está correta porque, na SDS-PAGE, o SDS desnatura as proteínas e lhes confere carga negativa uniforme, fazendo com que a separação dependa בעיקרamente do tamanho molecular. As assertivas II e III contrariam o sentido real da transferência no blot e o sistema enzimático usado na revelação, por isso não compõem a resposta.
- B)II, somente.
Esta opção afirma que somente a II estaria correta, isto é, que a membrana deveria ficar próxima ao polo negativo e que a transferência ocorreria do positivo para o negativo. Na prática, ocorre o oposto: as proteínas ligadas ao SDS migram em direção ao polo positivo, e a membrana é posicionada do lado do ânodo para receber o material. Como a II descreve o sentido inverso do processo, a alternativa está conceitualmente equivocada.
- C)I e II, somente.
Aqui se sustenta que as assertivas I e II estariam corretas. A I realmente procede, pois o SDS desnatura as proteínas e lhes dá carga negativa, mas a II erra ao inverter o sentido da transferência no Western blot, que leva as proteínas do gel para a membrana posicionada no lado positivo. Assim, a combinação proposta não se mantém.
- D)I e III, somente.
Esta alternativa combina a assertiva I com a III. A I está certa pela ação do SDS na desnaturação e na padronização da carga negativa, mas a III confunde o sistema de revelação: NBT/BCIP é substrato cromogênico típico da fosfatase alcalina, não da peroxidase. Para anticorpos conjugados à peroxidase, costumam ser usados outros reveladores, como DAB, TMB ou sistemas quimioluminescentes.
- E)II e III, somente.
A opção diz que as assertivas II e III estariam corretas. Ambas trazem erro específico: a II inverte a direção da migração das proteínas no transfer, e a III atribui ao NBT/BCIP a revelação de anticorpos ligados à peroxidase, quando esse reagente é clássico para fosfatase alcalina. Por isso, a combinação não corresponde ao procedimento real do Western blot.
Gabarito: A
No Western Blot, primeiro as proteínas são separadas por eletroforese em gel de poliacrilamida sob condições desnaturantes, geralmente com SDS. Esse detergente “embrulha” os polipeptídios, mascara a carga natural deles e deixa tudo com carga negativa proporcional ao tamanho. Resultado: a separação fica muito mais ligada ao peso molecular do que à forma da proteína. É a clássica lógica do método: primeiro separar, depois identificar, sem dar chance para a proteína se fazer de “disfarçada”. Na etapa de transferência para a membrana, as proteínas saem do gel e vão em direção ao eletrodo positivo, porque estão negativamente carregadas. Então a membrana deve ficar do lado do polo positivo, e não do negativo. Por isso, a afirmativa II está errada: a transferência não ocorre do polo positivo para o negativo. Já o NBT/BCIP não é o revelador típico de anticorpos conjugados à peroxidase. Esse substrato cromogênico é usado com frequência em sistemas ligados à fosfatase alcalina. Quando o anticorpo está conjugado à peroxidase, outros sistemas são mais comuns, como revelação quimioluminescente ou cromógenos específicos para essa enzima. Então a afirmativa III também está errada. Assim, somente a afirmativa I está correta, o que torna o gabarito A. Em resumo: SDS confere carga negativa às proteínas; a transferência vai para o lado positivo; e NBT/BCIP é cara de fosfatase alcalina, não de peroxidase.